单抗制备进阶课：Ig类/亚类鉴定试剂盒怎么用？
Time：2026-05-31 Click：189
你辛苦筛选出来的单克隆抗体，终于看到了阳性克隆。但有一个问题你可能还没回答：它是什么类型的抗体？是IgG还是IgM？如果是IgG，是IgG1、IgG2a、IgG2b还是IgG3？ 这个“身份信息”不仅决定了抗体的下游应用（如Protein A/G纯化、补体激活能力），更是论文发表和专利申报的必备数据。今天我们就来拆解小鼠单抗的Ig类/亚类鉴定——这个看似简单却至关重要的实验。
一、什么是Ig类/亚类鉴定？
小鼠的免疫球蛋白（Ig）分为多种类别和亚类，分别由不同的重链基因编码：
| 类别/亚类 | 重链类型 | 主要特征 |
|---|---|---|
| IgM | μ链 | 初次免疫应答，五聚体结构 |
| IgG1 | γ1链 | 最常用，Th2型免疫应答 |
| IgG2a | γ2a链 | Th1型免疫应答，强补体激活 |
| IgG2b | γ2b链 | 介于两者之间 |
| IgG3 | γ3链 | 较少见，铰链区较长 |
| IgA | α链 | 黏膜免疫 |
| IgE | ε链 | 过敏反应 |
此外，还有轻链类型（κ或λ），但单抗鉴定中最优先确定的是重链的类别/亚类。
为什么需要鉴定？
| 原因 | 说明 |
|---|---|
| 纯化方法选择 | 不同亚类与Protein A/G的结合能力不同 |
| 功能预期 | IgG2a比IgG1有更强的补体激活和ADCC效应 |
| 下游应用设计 | 二抗选择、检测系统优化 |
| 质量控制 | 确认杂交瘤分泌的是单克隆抗体 |
| 文献/专利要求 | 必需的基础数据 |
二、小鼠IgG各亚类的关键差异
| 特征 | IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 |
|---|---|---|---|---|
| 与Protein A结合 | 弱 | 强 | 强 | 强 |
| 与Protein G结合 | 强 | 强 | 强 | 强 |
| 补体激活能力 | 弱 | 强 | 中等 | 强 |
| ADCC效应 | 弱 | 强 | 中等 | 中等 |
| 铰链区长度 | 短 | 短 | 中等 | 长 |
| Th偏向性 | Th2 | Th1 | Th1/Th2混合 | 少见 |
这些差异意味着什么？
| 应用场景 | 推荐亚类 | 理由 |
|---|---|---|
| 治疗性抗体（需要ADCC） | IgG2a | 更强的效应功能 |
| 中和抗体（阻断受体） | IgG1 或 IgG2a | 两者均可 |
| 免疫组化（低背景） | IgG1（γ链特异性二抗成熟） | 背景控制好 |
| 流式细胞术 | 均可 | 需匹配二抗 |
| Protein A纯化 | 避免IgG1 | 结合弱，需用Protein G |
如果不鉴定亚类，直接用Protein A纯化IgG1——你可能什么都纯化不出来。
三、鉴定方法：ELISA法是最佳选择
基本原理
| 步骤 | 操作 | 目的 |
|---|---|---|
| 1 | 包被抗小鼠Ig（通用） | 捕获待测单抗 |
| 2 | 加入待测单抗（杂交瘤上清） | 让抗体被捕获 |
| 3 | 加入亚类特异性二抗（抗IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、κ、λ） | 识别不同亚类 |
| 4 | 加入酶标二抗（如HRP-抗亚类二抗） | 信号放大 |
| 5 | 显色、读数 | 判断阳性孔 |
结果判读：
| 孔 | 亚类特异性二抗 | 信号 | 结论 |
|---|---|---|---|
| A | 抗IgG1 | 强阳性 | IgG1型 |
| B | 抗IgG2a | 阴性 | — |
| C | 抗IgG2b | 阴性 | — |
| D | 抗IgG3 | 阴性 | — |
| E | 抗IgM | 阴性 | — |
该单抗为小鼠IgG1型，κ或λ轻链需进一步确认。
四、注意事项与常见问题
1. 捕获抗体的选择
| 捕获方式 | 优点 | 缺点 |
|---|---|---|
| 抗小鼠κ/λ轻链 | 捕获所有Ig（不分亚类） | 轻链通用性好 |
| 抗小鼠IgG（H+L） | 捕获所有IgG | 会漏检IgM/IgA/IgE |
| 抗小鼠Fc | 亚类捕获可能有偏差 | 不同亚类结合效率不同 |
推荐使用抗小鼠κ/λ轻链作为捕获抗体，确保所有Ig类别的单抗都被捕获。
2. 二抗的特异性
| 问题 | 后果 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 二抗交叉反应 | 多个孔同时阳性 | 换用高特异性亚类二抗 |
| 二抗浓度过高 | 背景升高 | 滴定优化 |
| 二抗浓度过低 | 假阴性 | 按推荐稀释度使用 |
3. 阳性对照
| 对照 | 用途 |
|---|---|
| 已知亚类的单抗 | 验证各亚类二抗的工作状态 |
| 空白对照（无一抗） | 检测背景水平 |
| 阴性对照（无关单抗） | 确认无交叉反应 |
五、结果解读指南
正常结果模式
| 结果模式 | 结论 |
|---|---|
| 仅一个亚类孔阳性 | ✅ 单克隆，亚类已确定 |
| 两个或以上亚类孔阳性 | ⚠️ 可能是：①二抗交叉反应 ②多克隆混合物 ③杂交瘤不纯 |
| 所有孔均为阴性 | ❌ 可能是：①上清中无抗体 ②捕获抗体失效 ③二抗失效 |
| 轻链孔阳性（κ或λ） | 确定轻链类型 |
异常结果的排查
| 异常 | 可能原因 | 排查方法 |
|---|---|---|
| 多孔阳性 | 二抗交叉反应 | 换用预吸附二抗 |
| 所有孔弱阳性 | 上清中抗体浓度低 | 浓缩上清或换用更灵敏的检测系统 |
| 背景高 | 封闭不充分 | 延长封闭时间或换封闭剂 |
六、亚类鉴定的时间点
| 阶段 | 是否建议做 | 理由 |
|---|---|---|
| 杂交瘤筛选后（扩增前） | ⚠️ 可选 | 上清中抗体浓度低，可能有假阴性 |
| 亚克隆后（稳定克隆） | ✅ 强烈建议 | 确认单克隆性 |
| 腹水制备后 | ✅ 推荐 | 腹水中抗体浓度高，鉴定更准确 |
| 纯化后 | ✅ 推荐 | 最终确认产品亚类 |
建议在稳定亚克隆后进行首次鉴定，纯化后再次确认。
七、不同亚类的下游应用建议
| 亚类 | 纯化建议 | 二抗选择 | 功能特点 |
|---|---|---|---|
| IgG1 | Protein G（不能用Protein A） | 抗小鼠IgG1（链特异性） | ADCC弱，中和活性好 |
| IgG2a | Protein A或G | 抗小鼠IgG2a | ADCC强，补体激活强 |
| IgG2b | Protein A或G | 抗小鼠IgG2b | 介于两者之间 |
| IgG3 | Protein G | 抗小鼠IgG3 | 铰链区长，补体激活强 |
| IgM | 不适用亲和纯化 | 抗小鼠IgM（μ链特异性） | 五聚体，强补体激活 |
八、总结
| 核心问题 | 答案 |
|---|---|
| 什么是Ig类/亚类鉴定？ | 确定单克隆抗体的重链类别（IgG1/IgG2a/IgG2b/IgG3/IgM等） |
| 为什么要做？ | ①决定纯化方法 ②预判功能特性 ③下游实验设计 ④文献/专利要求 |
| IgG1和IgG2a有什么不同？ | IgG2a补体激活和ADCC更强；IgG1更常见于Th2型应答 |
| 鉴定方法是什么？ | ELISA法：捕获抗体+亚类特异性二抗 |
| 能直接上Protein A纯化吗？ | 不能——IgG1与Protein A结合很弱，可能纯化失败 |
| 什么时候做最合适？ | 亚克隆稳定后做首次鉴定，纯化后再次确认 |
| 最容易被忽略的点？ | IgG1不能用Protein A纯化——这是新手最常犯的错误 |
给单抗做一次“身份证鉴定”，不只是为了填一份数据表格，而是为了知道：它能做什么、不能做什么、怎么用它才最好。
Previous：Western blot背景高、信号弱？可能是HRP二抗没用对 Next：轻链也是关键：抗κ轻链与抗λ轻链到底有什么不同？